動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)對象是離體的組織和細(xì)胞，對致病微生物及病毒無抵抗力，有被污染的危險，因此，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室不同于其他實(shí)驗(yàn)室之處就是要保持無菌。

一般來說，無菌條件并不是要花很多錢去創(chuàng)造一個很大的無菌區(qū)域，重要的是動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室建設(shè)上能夠防塵和不設(shè)立通道。使用超凈工作臺是創(chuàng)造無菌條件的簡便方法，能為局部提供無菌條件，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備進(jìn)行無菌操作、培養(yǎng)、準(zhǔn)備、清洗、消毒滅菌和儲存等六方面的功能。各個操作區(qū)域最好分別設(shè)置于相連的各個房間，特別是無菌操作室最好能單獨(dú)設(shè)置；如果各部門都安置在一個大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，無菌操作區(qū)與清洗、消毒滅菌區(qū)應(yīng)分別位于兩端，而準(zhǔn)備、儲存和培養(yǎng)區(qū)位于此兩區(qū)之間。

動物細(xì)胞培養(yǎng)室的各種工作區(qū)域具有不同的特性和用途，在進(jìn)行相應(yīng)的操作時，要嚴(yán)格遵守各區(qū)域的操作要求和規(guī)章制度。沃柏斯主要介紹動物細(xì)胞培養(yǎng)室的規(guī)劃和布局設(shè)置、各操作區(qū)域的功能、基本設(shè)施、設(shè)置要求、操作要求和注意事項(xiàng)。

一、動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計規(guī)劃

動物細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響，動物細(xì)胞培養(yǎng)室要求環(huán)境清潔，空氣清新、干燥、無塵。

動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室由準(zhǔn)備區(qū)、清洗區(qū)、消毒滅菌區(qū)、無菌操作區(qū)、培養(yǎng)區(qū)和儲存區(qū)6部分組成，這些區(qū)域的共同特點(diǎn)是房間要寬敞、明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質(zhì)地光滑堅硬，儀器設(shè)備布局合理，方便操作，避免交叉干擾，陳設(shè)簡潔，便于清掃。

1、潔凈度和粉塵

潔凈度是指潔凈空氣中空氣含塵(包括微生物)量多少的程度。粉塵是指懸浮在空氣中的固體微粒，習(xí)慣上稱塵、灰塵、塵埃、煙塵、粉末等。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織規(guī)定，粒徑小于75μm的固體懸浮物定義為粉塵。

空氣潔凈度等級是潔凈空間單位體積空氣中，以大于或等于被考慮粒徑的粒子最大濃度限值進(jìn)行劃分的等級標(biāo)準(zhǔn)，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的“中國標(biāo)準(zhǔn)”明確規(guī)定了潔凈度的4個等級。

潔凈度等級應(yīng)在空態(tài)、靜態(tài)和動態(tài)方法進(jìn)行測試，使用塵埃粒子測試儀來測定。

無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。細(xì)胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境要求很高，在細(xì)胞操作時，一般需要在100級空氣質(zhì)量條件下進(jìn)行。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。

2、溫度和濕度

體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞一樣，需要在恒定的溫度下生存，一般最適宜生長溫度為37°C， 溫度變化不應(yīng)超過土0. 5°C，這主要是由酶和蛋白質(zhì)所需的最適溫度決定的。溫度過低時細(xì)胞生長緩慢甚至不生長，溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞死亡，溫度升高2°C時，則不利于細(xì)胞生存，溫度達(dá)到40°C以.上細(xì)胞將很快死亡。

濕度是表示大氣干燥程度的物理量。空氣的干濕程度稱為‘濕度”。在一定溫度下，一定體積的空氣中含有的水氣越少，則空氣越干燥;水氣越多，則空氣越潮濕。

在此意義下，常用絕對濕度、相對濕度、比較濕度、混合比、飽和差以及露點(diǎn)等物理量來表示;若表示在濕蒸氣中水蒸汽的質(zhì)量占蒸氣總質(zhì)量(體積)的百分比，則稱之為蒸氣的濕度。濕度不夠或過高都不利于細(xì)胞生長。

二、動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的功能分區(qū)

動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備進(jìn)行無菌操作、培養(yǎng)、準(zhǔn)備、清洗、消毒滅菌和儲存6個方面的功能。動物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的6個區(qū)域最好都單獨(dú)設(shè)置，分別置于相連的各個房間，特別是無菌操作室最好能單獨(dú)設(shè)置;如果沒有條件，可以將這些區(qū)域都安置在一個大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，設(shè)計原則一般是無菌操作區(qū)與清洗、消毒滅菌區(qū)分別位于兩端，無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，而準(zhǔn)備、儲存和培養(yǎng)區(qū)位于此兩區(qū)之間，儀器設(shè)備安裝排列合理，便于清潔。

1、無菌操作區(qū)

無菌操作區(qū)是只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。在一般環(huán)境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，較易造成污染。因此，接種工作要在空氣經(jīng)過滅菌的環(huán)境里進(jìn)行，小規(guī)模的無菌環(huán)境可利用超凈工作臺創(chuàng)造，大規(guī)模的需建無菌室。

無菌室主要用于實(shí)驗(yàn)材料的接種操作，所以也稱接種室。

理想的無菌室應(yīng)有內(nèi)、外兩間，內(nèi)間是無菌操作間，外間是緩沖間。房間容積不宜過大，以便于空氣滅菌。緩沖間用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用，以保證操作間的無菌環(huán)境，同時可放置恒溫培養(yǎng)箱以及必需的小型儀器。

無菌操作間則專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)，其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高以保證紫外線的滅菌效果;內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)用塑鋼板或瓷磚裝修，墻壁光滑無死角以便清洗和消毒。

無菌操作間容積小且為密閉式，一般無菌操作間的空氣消毒用紫外線燈，有的實(shí)驗(yàn)室使用無臭氧紫外線消毒器或電子消毒滅菌器。無菌室內(nèi)間當(dāng)設(shè)拉門，以減少空氣的波動，拉門應(yīng)設(shè)在離工作臺最遠(yuǎn)的位置上;外間的門最好也用拉門，且應(yīng)與內(nèi)間的門錯開，要設(shè)在距內(nèi)間最遠(yuǎn)的位置上，兩個門也不要同時開啟，以保證無菌室不因開門和人的進(jìn)出帶進(jìn)雜菌;

緩沖間內(nèi)應(yīng)該設(shè)有水槽、鞋帽架、柜子和紫外燈，備有消毒服裝、鞋、帽、口罩、盆、手持噴霧器等。內(nèi)間應(yīng)配有工作臺、紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等，工作人員進(jìn)入操作間要穿上消過毒的工作服和拖鞋。

在條件比較簡單的實(shí)驗(yàn)室，要進(jìn)行組織細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可以采用自制的單人或雙人無菌操作箱。箱內(nèi)可安裝紫外線燈供消毒滅菌和日光燈供照明,操作時僅雙手伸入箱內(nèi)，也可達(dá)到一定的無菌條件。由于箱內(nèi)空氣不流動，溫度較高，因此操作時間不宜太長，僅可做一般的細(xì)胞培養(yǎng)工作。無菌操作區(qū)的常用的設(shè)備和用具有1-2臺 超凈工作臺，配有酒精燈、鑷子、剪刀、不銹鋼的器具、75%的酒精棉球、特種蠟筆、鉛筆、記錄本、標(biāo)簽紙、廢物筐等。

無菌室容積小而嚴(yán)密，使用一段時間后，室內(nèi)溫度很高，故應(yīng)設(shè)置通氣窗。

2、培養(yǎng)區(qū)

培養(yǎng)區(qū)為組織細(xì)胞提供適宜溫度進(jìn)行培養(yǎng):培養(yǎng)區(qū)對無菌的要求不像無菌區(qū)那樣嚴(yán)格，但仍需清潔、無塵，因此也應(yīng)設(shè)在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。小規(guī)模的培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，大規(guī)模的培養(yǎng)需在可控制溫度的培養(yǎng)室中進(jìn)行。

為了控制培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)室最好設(shè)在陽光不能直接照射的地方，一般用拉門，以防止空氣流動，并留一個通氣窗，安上排氣扇，室內(nèi)溫度由空調(diào)控制。天花板和內(nèi)墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設(shè)，要光滑無死角，以便于清潔和消毒，也不易在墻角堆積灰塵。培養(yǎng)室外應(yīng)有預(yù)備間或走廊。

建培養(yǎng)室成本費(fèi)用較高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)區(qū)應(yīng)配有搖床、生化培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱等。

3、儲存區(qū)

儲存區(qū)用于存放無菌培養(yǎng)液、試劑、培養(yǎng)瓶和樣品，要求取放物品方便，環(huán)境也需要清潔、無塵。為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般為液氮溫度-196C。

4、準(zhǔn)備區(qū)

準(zhǔn)備區(qū)用于配制培養(yǎng)液和有關(guān)培養(yǎng)用的液體等。應(yīng)設(shè)有試劑柜、器械柜、實(shí)驗(yàn)臺和上水道、電源等，配備的主要儀器設(shè)備有水純化裝置、天平、微波爐、pH計、抽氣泵、電爐、培養(yǎng)分裝器、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、pH計、磁力拌器等設(shè)備下完成制備以后，應(yīng)在無菌操作臺進(jìn)行過濾除菌。液體制備直接關(guān)系組織細(xì)胞養(yǎng)的成敗，因此必須嚴(yán)格無菌操作。

5、清洗區(qū)

清洗區(qū)用于洗刷所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿等，在實(shí)驗(yàn)室的一側(cè)應(yīng)設(shè)置專用的洗滌水池，用來洗玻璃器皿，備有各種瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等，中央實(shí)驗(yàn)臺還應(yīng)配置小水槽，用來清小型玻璃器皿。

清洗區(qū)應(yīng)配有柜子、加熱器、蒸鍋，洗刷器皿用的盆、桶等，有條件可配置玻器皿清洗機(jī)，此外還應(yīng)配置落水架、干燥箱、超聲波清洗器等。清洗區(qū)地面應(yīng)耐濕，設(shè)置地并排水良好

6、消毒滅菌區(qū)

直接或間接與細(xì)胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。消毒滅菌區(qū)主要用于培養(yǎng)液的滅和各種器具的消毒滅菌，應(yīng)備有高壓蒸汽滅菌鍋、細(xì)菌過濾設(shè)備、電熱干燥箱、

消毒柜、排風(fēng)火設(shè)備等。清洗和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)分開。

三、動物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的規(guī)章制度

①每次實(shí)驗(yàn)前必須充分預(yù)習(xí)，熟悉實(shí)驗(yàn)操作中主要步驟和環(huán)節(jié)，了解儀器的性能和操方法。

②嚴(yán)禁將與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品帶人實(shí)驗(yàn)室。

③除嚴(yán)格按規(guī)程進(jìn)行無菌操作，要培養(yǎng)良好習(xí)慣以防染菌或污染環(huán)境，并做好必要的全防護(hù)。

實(shí)驗(yàn)前清洗雙手，用75%酒精棉球擦手，用濕布擦凈臺面，必要時可用新潔爾滅(扎溴銨)溶液;進(jìn)行接種操作時，要關(guān)閉門窗，以防空氣對流，保持安靜和良好秩序，盡量減少走動和說話，以防塵埃飛揚(yáng)和唾沫飛濺；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙和飲食;凡需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，應(yīng)注明名稱、接種日期及操作者姓名(或組別)，放在指定的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);帶菌移液管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等器材，應(yīng)置于專用盤、架，確定不再使用后，應(yīng)立即投入消毒液中浸泡20min以上，或煮沸0.5h或進(jìn)行蒸汽滅菌后再清洗；離開實(shí)驗(yàn)室前要用肥皂洗手;實(shí)驗(yàn)室中物品未經(jīng)許可，不得攜帶出實(shí)驗(yàn)室。

④愛護(hù)儀器、設(shè)備，認(rèn)真按操作規(guī)程使用儀器、設(shè)備,并作好使用記錄。

⑤認(rèn)真做好細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)記錄，以了解細(xì)胞生長情況，清晰填寫實(shí)驗(yàn)報告

⑥發(fā)行意外情況時，應(yīng)立即報告，在相關(guān)管理人員指導(dǎo)下及時處理。

⑦節(jié)約水、電、試劑，適量取用實(shí)驗(yàn)藥品等耗材。

⑧實(shí)驗(yàn)完畢清除雜物，認(rèn)真清洗器皿、清理試劑、清潔臺面、保養(yǎng)儀器，物品歸類還原。

⑨值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門、窗，經(jīng)相關(guān)管理人員檢查實(shí)驗(yàn)室安全，方可離開實(shí)驗(yàn)室。